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防腐劑廠家介紹一下《急性經(jīng)口毒性試驗 急性毒性分類法》

1   范圍

  本規(guī)范規(guī)定了動物急性經(jīng)口毒性試驗 急性毒性分類法的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學檢測。

2   試驗目的

急性經(jīng)口毒性試驗是評估化妝品原料毒性特性的第一步，通過短時間經(jīng)口染毒可提供對健康危害的信息，作為化妝品原料毒性分級和標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗和其他毒理學試驗劑量的依據(jù)。急性毒性分類方法用較少的動物逐步試驗，不用計算受試物精確的 LD ₅₀ 數(shù)值及可信限范圍，可以直接確定受試物的急性經(jīng)口毒性及其分類。

3  定義

3.1   急性經(jīng)口毒性  acute oral toxicity

一次或在 24 h 內(nèi)多次經(jīng)口給予實驗動物受試物后，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應。

3.2   經(jīng)口 LD₅₀ 半數(shù)致死量  medium lethal dose

經(jīng)口一次給予受試物后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學劑量。以單位體重接受受試物的重量 (mg/kg或 g/kg)來表示。

3.3  限值劑量  limit dose

受試動物進行急性經(jīng)口毒性試驗的上限劑量（ 2000 mg/kg或 5000 mg/kg）。

4  試驗的基本原則

本方法的原則是在使用最少動物數(shù)逐步進行試驗，以獲得受試物的急性毒性分類所需的充分結果。受試物按規(guī)定的劑量經(jīng)口給予一組實驗動物，每一步使用 3只單一性別的動物 (通常為雌性 )。一個步驟中動物是否存在與化合物相關的死亡率將決定下一個步驟，即：

-無需進一步測試；

-同一劑量水平再做 3只動物；

-在高一級或低一級劑量水平劑量另做 3只動物。

5  試驗方法

5.1  受試物

受試物應溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中，建議首選水，其次考慮使用植物油（如玉米油）或其他介質(zhì)（如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等），制成溶液、混懸液或乳濁液。對非水介質(zhì)，應了解其毒理特性，否則應在試驗前先確定其毒性。每次經(jīng)口染毒液體的最大容量取決于實驗動物的大小，對嚙齒類動物所給液體容量一般為 1 mL/100  g，水溶液可至 2 mL/100  g。通過調(diào)整受試物溶液濃度使各劑量組經(jīng)口染毒的容量一致。

5.2  實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年大鼠，也可選用其他嚙齒動物。通常選用單一性別大鼠。在結構類似物的毒性和毒代動力學信息無提示雄性為更為敏感性別動物的前提下，一般選用雌性動物進行試驗。當用雄性大鼠做試驗時，要提供充分的理由。

應選用年輕健康動物和非經(jīng)產(chǎn)、未受孕的雌性動物。在試驗開始時，動物應在 8周 ~12周齡，體重變異應不超過平均體重的 ±20%。如果進行連續(xù)的試驗，要注意確保在整個研究中動物的體重和周齡符合要求。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應 3~5  d時間。

    實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用標準配合飼料，飲水不限制。

5.3  劑量水平

每一步使用 3 只動物。根據(jù)受試物的相關毒理學資料或通過結構類似化合物或類似混合物（根據(jù)性質(zhì)和所占的比例判斷受試物所占的毒性重要性）的毒性資料獲得，初始劑量水平從 5 、 50、 300和 2000 mg/kg 4個固定劑量中選擇。初始劑量最好能引起受試動物一定的死亡。每種初始劑量應遵循的試驗程序詳見附錄的流程圖。

當現(xiàn)有的毒理學資料提示，最高初始劑量不引起動物死亡時，應做限量試驗；如無受試物的相關資料，出于動物福利原則，應將初始劑量定為 300 mg/kg。

各劑量組間給樣的時間間隔由毒作用快慢、持續(xù)時間和嚴重程度決定。當確信前一劑量組的動物能夠存活時才可進行下一劑量組的試驗。

在特殊情況或確實需要時，可考慮進行 5000 mg/kg劑量水平的試驗。出于動物福利的考慮，受試物只有在試驗結果極有可能與保護人類、動物或環(huán)境直接相關時才考慮進行這一劑量的試驗。

5.4  試驗步驟

5.4.1  染毒  

試驗前，實驗動物禁食不禁水（大鼠禁食不禁水過夜，小鼠禁食不禁水 3 h~4 h）。禁食期過后，稱量動物體重，用管飼法一次進行染毒，若估計受試物毒性很低，一次給予容量太大，也可在 24 h內(nèi)分 2~3次染毒，但合并作為一次劑量計算。染毒后繼續(xù)大鼠禁食 3 h~4 h，小鼠禁食 1 h~2 h。若采用分批多次染毒，根據(jù)染毒間隔長短，必要時可給動物一定量的食物和水。

5.4.2  限量試驗

當現(xiàn)有的毒理學資料提示受試物很可能是無毒的情況下，可進行限量試驗。相關毒性資料可來源于類似結構的化合物、混合物或產(chǎn)品。 2000 mg/kg劑量的限量試驗使用 6只動物（每步 3只）開展（見附錄）。

在個別情況下，如有監(jiān)管需要，可用 3只動物進行 5000 mg/kg劑量的限量試驗。如第 1只動物死亡，需進行 2000 mg/kg劑量的試驗程序；若第 1只動物存活，則再對 2只動物染毒。如 3只動物死亡 1只或不死亡，則受試物 LD₅₀ 大于 5000 mg/kg，毒性分類為實際無毒；否則需要進行 2000 mg/kg劑量的試驗程序。

5.4.3  觀察

5.4.3.1  染毒后，對每只動物都應有單獨全面的記錄，在染毒后的 30 min內(nèi)每只動物至少分別觀察一次，第 1 d內(nèi)要定時觀察（在前 4 h內(nèi)要特別注意）實驗動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進行一次仔細的檢查。詳細記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時間和死亡時間。發(fā)現(xiàn)處于瀕死狀態(tài)動物以及動物表現(xiàn)出劇烈的疼痛或持續(xù)嚴重痛苦的病癥時給予人道處死。當動物因人道原因處死或被發(fā)現(xiàn)死亡時，應盡可能準確地記錄死亡時間。

5.4.3.2  觀察期限一般不超過 14 d，但觀察時間并非一成不變，要視動物中毒反應的嚴重程度、癥狀出現(xiàn)快慢和恢復期長短而定。若有延遲死亡跡象，可延長觀察時間。

觀察期內(nèi)存活動物每周稱重，觀察期結束存活動物應稱重，處死后進行尸檢。

5.4.4  對全部動物進行大體解剖學檢查，并記錄全部大體病理改變。對存活 24 h和 24 h以上動物并存在大體病理改變的器官可進行病理組織學檢查。

5.5  試驗結果評價

評價試驗結果時，應將毒性分類級別與觀察到的毒性效應和尸檢所見相結合考慮，急性毒性分類結果是受試物毒性分級和標簽標識以及判定受試物經(jīng)消化道攝入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。

在引用 LD₅₀ 分界值和急性毒性的分類結果時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價應包括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其他毒性作用 ) 的發(fā)生率和嚴重程度之間的關系。

毒性分級見表1 。

表1  毒性分級表

6  試驗結果的解釋

通過急性經(jīng)口毒性試驗和急性毒性的分類可評價受試物的毒性，其結果外推到人類的有效性很有限。

本文轉自國家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)