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防腐劑廠家介紹一下《急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 急性毒性分類法》

1   范圍

  本規(guī)范規(guī)定了動(dòng)物急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 急性毒性分類法的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學(xué)檢測。

2   試驗(yàn)?zāi)康?/span>

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)是評估化妝品原料毒性特性的第一步，通過短時(shí)間經(jīng)口染毒可提供對健康危害的信息，作為化妝品原料毒性分級和標(biāo)簽標(biāo)識以及確定亞慢性毒性試驗(yàn)和其他毒理學(xué)試驗(yàn)劑量的依據(jù)。急性毒性分類方法用較少的動(dòng)物逐步試驗(yàn)，不用計(jì)算受試物精確的 LD ₅₀ 數(shù)值及可信限范圍，可以直接確定受試物的急性經(jīng)口毒性及其分類。

3  定義

3.1   急性經(jīng)口毒性  acute oral toxicity

一次或在 24 h 內(nèi)多次經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試物后，動(dòng)物在短期內(nèi)出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。

3.2   經(jīng)口 LD₅₀ 半數(shù)致死量  medium lethal dose

經(jīng)口一次給予受試物后，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué)劑量。以單位體重接受受試物的重量 (mg/kg或 g/kg)來表示。

3.3  限值劑量  limit dose

受試動(dòng)物進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的上限劑量（ 2000 mg/kg或 5000 mg/kg）。

4  試驗(yàn)的基本原則

本方法的原則是在使用最少動(dòng)物數(shù)逐步進(jìn)行試驗(yàn)，以獲得受試物的急性毒性分類所需的充分結(jié)果。受試物按規(guī)定的劑量經(jīng)口給予一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每一步使用 3只單一性別的動(dòng)物 (通常為雌性 )。一個(gè)步驟中動(dòng)物是否存在與化合物相關(guān)的死亡率將決定下一個(gè)步驟，即：

-無需進(jìn)一步測試；

-同一劑量水平再做 3只動(dòng)物；

-在高一級或低一級劑量水平劑量另做 3只動(dòng)物。

5  試驗(yàn)方法

5.1  受試物

受試物應(yīng)溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中，建議首選水，其次考慮使用植物油（如玉米油）或其他介質(zhì)（如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等），制成溶液、混懸液或乳濁液。對非水介質(zhì)，應(yīng)了解其毒理特性，否則應(yīng)在試驗(yàn)前先確定其毒性。每次經(jīng)口染毒液體的最大容量取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大小，對嚙齒類動(dòng)物所給液體容量一般為 1 mL/100  g，水溶液可至 2 mL/100  g。通過調(diào)整受試物溶液濃度使各劑量組經(jīng)口染毒的容量一致。

5.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年大鼠，也可選用其他嚙齒動(dòng)物。通常選用單一性別大鼠。在結(jié)構(gòu)類似物的毒性和毒代動(dòng)力學(xué)信息無提示雄性為更為敏感性別動(dòng)物的前提下，一般選用雌性動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)用雄性大鼠做試驗(yàn)時(shí)，要提供充分的理由。

應(yīng)選用年輕健康動(dòng)物和非經(jīng)產(chǎn)、未受孕的雌性動(dòng)物。在試驗(yàn)開始時(shí)，動(dòng)物應(yīng)在 8周 ~12周齡，體重變異應(yīng)不超過平均體重的 ±20%。如果進(jìn)行連續(xù)的試驗(yàn)，要注意確保在整個(gè)研究中動(dòng)物的體重和周齡符合要求。試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng) 3~5  d時(shí)間。

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。

5.3  劑量水平

每一步使用 3 只動(dòng)物。根據(jù)受試物的相關(guān)毒理學(xué)資料或通過結(jié)構(gòu)類似化合物或類似混合物（根據(jù)性質(zhì)和所占的比例判斷受試物所占的毒性重要性）的毒性資料獲得，初始劑量水平從 5 、 50、 300和 2000 mg/kg 4個(gè)固定劑量中選擇。初始劑量最好能引起受試動(dòng)物一定的死亡。每種初始劑量應(yīng)遵循的試驗(yàn)程序詳見附錄的流程圖。

當(dāng)現(xiàn)有的毒理學(xué)資料提示，最高初始劑量不引起動(dòng)物死亡時(shí)，應(yīng)做限量試驗(yàn)；如無受試物的相關(guān)資料，出于動(dòng)物福利原則，應(yīng)將初始劑量定為 300 mg/kg。

各劑量組間給樣的時(shí)間間隔由毒作用快慢、持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度決定。當(dāng)確信前一劑量組的動(dòng)物能夠存活時(shí)才可進(jìn)行下一劑量組的試驗(yàn)。

在特殊情況或確實(shí)需要時(shí)，可考慮進(jìn)行 5000 mg/kg劑量水平的試驗(yàn)。出于動(dòng)物福利的考慮，受試物只有在試驗(yàn)結(jié)果極有可能與保護(hù)人類、動(dòng)物或環(huán)境直接相關(guān)時(shí)才考慮進(jìn)行這一劑量的試驗(yàn)。

5.4  試驗(yàn)步驟

5.4.1  染毒  

試驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水（大鼠禁食不禁水過夜，小鼠禁食不禁水 3 h~4 h）。禁食期過后，稱量動(dòng)物體重，用管飼法一次進(jìn)行染毒，若估計(jì)受試物毒性很低，一次給予容量太大，也可在 24 h內(nèi)分 2~3次染毒，但合并作為一次劑量計(jì)算。染毒后繼續(xù)大鼠禁食 3 h~4 h，小鼠禁食 1 h~2 h。若采用分批多次染毒，根據(jù)染毒間隔長短，必要時(shí)可給動(dòng)物一定量的食物和水。

5.4.2  限量試驗(yàn)

當(dāng)現(xiàn)有的毒理學(xué)資料提示受試物很可能是無毒的情況下，可進(jìn)行限量試驗(yàn)。相關(guān)毒性資料可來源于類似結(jié)構(gòu)的化合物、混合物或產(chǎn)品。 2000 mg/kg劑量的限量試驗(yàn)使用 6只動(dòng)物（每步 3只）開展（見附錄）。

在個(gè)別情況下，如有監(jiān)管需要，可用 3只動(dòng)物進(jìn)行 5000 mg/kg劑量的限量試驗(yàn)。如第 1只動(dòng)物死亡，需進(jìn)行 2000 mg/kg劑量的試驗(yàn)程序；若第 1只動(dòng)物存活，則再對 2只動(dòng)物染毒。如 3只動(dòng)物死亡 1只或不死亡，則受試物 LD₅₀ 大于 5000 mg/kg，毒性分類為實(shí)際無毒；否則需要進(jìn)行 2000 mg/kg劑量的試驗(yàn)程序。

5.4.3  觀察

5.4.3.1  染毒后，對每只動(dòng)物都應(yīng)有單獨(dú)全面的記錄，在染毒后的 30 min內(nèi)每只動(dòng)物至少分別觀察一次，第 1 d內(nèi)要定時(shí)觀察（在前 4 h內(nèi)要特別注意）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進(jìn)行一次仔細(xì)的檢查。詳細(xì)記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動(dòng)和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應(yīng)記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間和死亡時(shí)間。發(fā)現(xiàn)處于瀕死狀態(tài)動(dòng)物以及動(dòng)物表現(xiàn)出劇烈的疼痛或持續(xù)嚴(yán)重痛苦的病癥時(shí)給予人道處死。當(dāng)動(dòng)物因人道原因處死或被發(fā)現(xiàn)死亡時(shí)，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地記錄死亡時(shí)間。

5.4.3.2  觀察期限一般不超過 14 d，但觀察時(shí)間并非一成不變，要視動(dòng)物中毒反應(yīng)的嚴(yán)重程度、癥狀出現(xiàn)快慢和恢復(fù)期長短而定。若有延遲死亡跡象，可延長觀察時(shí)間。

觀察期內(nèi)存活動(dòng)物每周稱重，觀察期結(jié)束存活動(dòng)物應(yīng)稱重，處死后進(jìn)行尸檢。

5.4.4  對全部動(dòng)物進(jìn)行大體解剖學(xué)檢查，并記錄全部大體病理改變。對存活 24 h和 24 h以上動(dòng)物并存在大體病理改變的器官可進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

5.5  試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)

評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)將毒性分類級別與觀察到的毒性效應(yīng)和尸檢所見相結(jié)合考慮，急性毒性分類結(jié)果是受試物毒性分級和標(biāo)簽標(biāo)識以及判定受試物經(jīng)消化道攝入后引起動(dòng)物死亡可能性大小的依據(jù)。

在引用 LD₅₀ 分界值和急性毒性的分類結(jié)果時(shí)一定要注明所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價(jià)應(yīng)包括動(dòng)物接觸受試物與動(dòng)物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)及其他毒性作用 ) 的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。

毒性分級見表1 。

表1  毒性分級表

6  試驗(yàn)結(jié)果的解釋

通過急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和急性毒性的分類可評價(jià)受試物的毒性，其結(jié)果外推到人類的有效性很有限。

本文轉(zhuǎn)自國家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)