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       化妝品挑戰(zhàn)性試驗就是用來測定防腐劑有效抗菌的最低濃度,是用來決定化妝品配方中防腐劑的用量,無論是化妝品新配方的開發(fā)或現(xiàn)有的產(chǎn)品,以及新防腐劑的開發(fā)使用,均應(yīng)作防腐效能試驗。防腐效能試驗是在化妝品樣中加入微生物,根據(jù)微生物的存活和增減的數(shù)量來判定所加防腐劑的量是否合適。

        所有的化妝品在生產(chǎn)和消費者使用過程中都面臨著受到微生物污染的可能。大多數(shù)化妝品的制造原材料不是無菌的,但生產(chǎn)過程中沒有采用無菌程序,沒有滅菌過程,而且常常裝在多次使用過的包裝容器內(nèi),這就可能造成微生物的一次污染。大多數(shù)化妝品具體營養(yǎng)成分和水分利于微生物生長和繁殖的條件,當有足夠的水分和營養(yǎng)成分存在時,產(chǎn)品除非有適宜的防腐劑存在,否則微生物將會迅速繁殖,脫水產(chǎn)品如眼影、粉底、礦物油等雖然沒有微生物生長所必需的水分,但它們在反復(fù)的使用過程中都有被二次污染的可能。二次污染是很難避免的,只能從加強防腐能力和減少細菌入侵著手,如選擇合適的防腐體系、封閉良好的包裝。產(chǎn)品的微生物污染不僅影響產(chǎn)品的功能和穩(wěn)定性,而且最重要的是影響使用時的安全性,使用污染了的產(chǎn)品會給消費者造成健康威脅，因此在化妝品中常添加不同種類的防腐劑來防止微生物的大量繁殖,化妝品中防腐劑的存在減少了微生物存在的幾率。

主要檢測方法

CTFA法

CIFA法用微生物包括:G+球菌如金黃色葡萄球菌;G-桿菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌;霉菌如黑曲霉、白色念珠菌。另外需氧產(chǎn)芽孢菌如蠟芽孢桿菌和枯草芽孢桿蘭等可選用。CIFA使用的細蘭培養(yǎng)基包括NA、TSA(水解大豆瓊開培養(yǎng)基)、EA(瓊脂培養(yǎng)基)。適宜于真蘭生長的培養(yǎng)包括PDA(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)或MA(瓊脂培養(yǎng)基)。當菌體生長好后,可將細菌或酵母菌于5℃下斜面保存,霉菌可在室溫下斜面保存。在準備接種物時,可以用肉湯或瓊培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌和酵母菌,收獲的菌體用于微生物檢驗。在進行微生物檢驗時,一般取20g或20mL樣品,微生物的接種濃度控制在1x10°CUmL(或g)產(chǎn)物,眼部用品酵母菌和菌濃度1x10CFU/mL(或g)產(chǎn)物。為了獲得每種或每類群微生物的試臉數(shù)據(jù),CTFA傾向于使用純培養(yǎng)物或相當類似的微生物來接種,體積不應(yīng)超過總體積的1%,這些檢驗水平提供了比通常消費者使用可能性更高的細菌污染機會。加之,在產(chǎn)品設(shè)計時許多產(chǎn)品還有保護性體系,即加入略多一些的防腐劑,因此,大多數(shù)經(jīng)檢驗后確定的防腐劑濃度保證了品可以在消費者使用期間抵抗污染。一般來講細菌的培養(yǎng)溫度為35-37℃,真菌采用23-28℃培養(yǎng)。CTFA推薦混合測試的樣品分別于0、1、23天(僅用于眼部的化妝品)、7、14和28天觀察微生物的生長情況，有部分檢驗可能多于28天。有些產(chǎn)品還進行重復(fù)性的防腐試驗來估計防腐劑在產(chǎn)中的適應(yīng)性,用某一特定的微生物防腐試驗可以得出使防腐系統(tǒng)失去效力所需的檢驗次數(shù)。CTFA所推薦的含有中和劑的稀培養(yǎng)基有:LBL,LBLT,TGB或WB。當使用傾注平板法培養(yǎng)時,加人培養(yǎng)基中的卵磷脂或吐溫-80就可以中和大多數(shù)防腐劑,并使產(chǎn)品均勻分布,對細菌、酵母和真菌來講Letheen瓊脂培養(yǎng)基是最常使用的培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基還適用于厭氧菌的生長,對于中和季銨鹽類化合物十分有效。其他的CTFA推薦的培養(yǎng)基有:TSA、NA、,TA、EA、TCG-YEA、D-E培養(yǎng)基以及 TSAPL，其他還有使真菌富集的培養(yǎng)基,如右旋葡萄糖瓊脂, Mycophil瓊脂, Mycological瓊脂和 Eugen-gr。如果防腐劑是汞或其他重金屬,則應(yīng)采用硫代乙醇酸的培養(yǎng)基。

USP法

USP所用的微生物包括:金黃色葡萄球菌(ATcC6538)、大腸桿菌(ATCC8739)、鋼綠假單胞菌(ATC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉( ATCC6404)。USP采用的培養(yǎng)基是SCDA(大豆酪蛋白消化性瓊脂培養(yǎng)),因為它可以使微生物旺盛地生長。故USP方法建議用此培養(yǎng)基來活化菌種。將保存的菌種在固體培養(yǎng)基上接種。細菌的培養(yǎng)在35℃下培養(yǎng)18~24h,酵母在20~25℃下培養(yǎng)48h,絲狀真菌在20-25℃下培養(yǎng)一周,菌種培養(yǎng)后用無菌生理鹽水收集細菌和酵母菌體,并將其稀釋到1×103cFU/mL,絲狀真菌用含0.05%吐溫-80的無菌水收集并將孢子濃度調(diào)至1×10CFUmL。由于菌懸液的濃度決定了試驗中的接種量,因此,應(yīng)控制好菌液的濃度。另外,菌懸液制備好后應(yīng)立即使用,否則將影響菌懸液中菌體的存活性。當產(chǎn)品的包裝容器不能進行接種和無菌取樣時,應(yīng)取20mL的產(chǎn)品至一個無菌的帶蓋的細菌試管中,以0.01mL的接種液:20mL試驗樣品的比例進行接種接種液中的微生物濃度應(yīng)控制在1x103-1×10°CF/mL之間,接種后在20~25℃下培養(yǎng),微生物的計數(shù)采用平板計數(shù)法來確定。以這個數(shù)來計算產(chǎn)品中的初始菌體濃度。并于第7,14,28天分別進行檢測,并計算APC,試驗者可根據(jù)初始菌體濃度,計算出APC的變化。根據(jù)這種方法,一種有效的防腐體系可以在14天后將細菌生存數(shù)減至初始濃度的0.1%,酵母和霉菌生存水平可能會更低。在試驗后期階段,必須低于或維持這些既定的水平。

評價標準

USP認為如果產(chǎn)品能做到以下幾個方面就說明防腐劑系統(tǒng)有效：

1. 在14天內(nèi)存活菌數(shù)達到初始菌數(shù)的0.1%;

2. 酵母菌和霉菌沒有菌絲生長;

3. 在28天保存試驗中所有測試的微生物都保持或低于所設(shè)計的微生物水平。

CTFA的評價標準認為如果產(chǎn)品能做到以下幾個方面,就說明防腐劑系統(tǒng)有效：

1. 在測試樣品保存7天內(nèi)細菌營養(yǎng)細胞應(yīng)減少99.9%以上,并在試驗期間繼續(xù)減少;

2. 酵母蘭和曹應(yīng)減少90%以上,并在試驗期間繼續(xù)減;

3. 在整個試驗期間可抑制芽孢的萌發(fā)。

       上述兩種防腐效能試驗方法,為防腐效能試驗方法的選擇提供了參考,但防腐劑挑戰(zhàn)試驗在國際上并沒有統(tǒng)一的標準。結(jié)合找到實驗數(shù)據(jù)與實際情況的關(guān)聯(lián),從企業(yè)的現(xiàn)狀選擇方法,不失為一種很好的選擇。